上海生科院研究肠病毒71型2B离子通道获新进展,

来源:http://www.020tL.com 作者:科技资讯 人气:188 发布时间:2019-09-23
摘要:3月7日, Protein Yu F, et al. Eur J Med Chem 2014, 77,258)。另外,该研究团队与叶敏教授课题组合作,发现甘草次酸类五环三萜衍生物同样较好抑制流感病毒进入细胞活性,研究结果发表在天然

3月7日,Protein & Cell 在线发表了中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所国家蛋白质科学中心研究员欧阳波和周界文的研究成果。该研究揭示了小分子抑制剂HMA在丙型肝炎病毒离子通道p7内的结合位点,并与另一广谱性抑制剂金刚烷乙胺的结合位点进行了比较,对于研发针对p7为靶点的靶向药物分子起到关键的指导作用。

7月9日,国际学术期刊Structure在线发表了中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所/国家蛋白质科学中心·上海研究员周界文和欧阳波的一项研究成果。在该项研究中,研究人员利用核磁共振技术和蛋白体脂质体转运技术,揭示了MgATP在线粒体转运蛋白SCaMC中的结合位点,并鉴定出该位点中的一个天冬氨酸残基Asp361对MgATP的高选择性起着关键作用。

核心提示:近日来自中国科学院上海生命科学研究院巴斯德所的研究人员在肠病毒71型2B离子通道上的合作研究上取得新进展

“天然药物及仿生药物”国家重点实验室周德敏教授、张礼和院士研究团队在抗RNA病毒药物研究方面取得了一系列突破,相关成果连续发表在药物化学学科的代表性杂志上。

丙型肝炎病毒是目前威胁人类健康的一类顽固型病毒,可诱发肝炎、肝硬化,继而引发肝癌。迄今为止还没有研发出有效控制HCV的预防或治疗性疫苗,药物治疗的选择也很有限。因此,迫切需要进一步研究丙肝病毒生活史,以病毒基因复制、颗粒组装过程中重要蛋白为靶点,研究合适的抑制剂,寻找消灭丙肝病毒的有效途径。p7是丙肝病毒编码的唯一一个离子通道蛋白,在病毒基因复制中起到关键作用,被作为一个潜在的药物靶点得到广泛的关注和研究。相关研究表明p7可以被金刚烷乙胺、HMA等小分子抑制。但这两类分子结构上截然不同,它们与p7结合的机制是否相同?解答这一问题,将为基于结构的抗丙肝病毒理性药物设计奠定科学依据。

线粒体是合成ATP为细胞提供能量的主要场所。ATP在线粒体内部产生后,必须穿过线粒体内膜被转运到细胞质中被细胞利用。这个转运过程主要是通过两个转运蛋白实现的,分别是AAC(ADP/ATP carrier)和SCaMC(short Ca2+-binding mitochondrial carrier)。这两个蛋白是属于线粒体载体家族(mitochondrial carrier family)的同源蛋白,其序列有30%左右的相似性。AAC和SCaMC都能转运ATP,但是只有SCaMC可以转运MgATP。而且,SCaMC转运MgATP的速率要远高于ATP,即SCaMC对MgATP有更高的选择性。那么,SCaMC为什么会对转运MgATP具有更高的选择性呢?目前学术界对这种选择性的结构基础尚不清楚。

近日来自中国科学院上海生命科学研究院巴斯德所的研究人员在肠病毒71型2B离子通道上的合作研究上取得新进展,相关研究论文发表在重要核心学术期刊《细胞研究》(Cell Research)上。

由RNA病毒引起的包括流感、丙肝、艾滋病、SARS和埃博拉出血热等传染性疾病严重危害着人类的健康。而且RNA病毒基因复制具有高突变率,对传统抑制病毒复制过程为主的抗病毒药物较易产生耐药性,也难以产生有效疫苗,因此亟待在抗病毒药物的作用机制上寻求突破。病毒进入细胞的过程处于病毒复制的上游,由于涉及与突变率低的宿主细胞的相互作用,有可能构成抗病毒药物研发的新契机。

在欧阳波和周界文的指导下,博士研究生赵琳琳成功纯化出状态均一、有生物活性的p7蛋白。运用甲基谱滴定的方法,比较在金刚烷乙胺、HMA滴定下蛋白质谱图的不同,发现在蛋白结构变化剧烈的顶端化学位移变化相似,但是在中间25位缬氨酸,与金刚烷乙胺不同,HMA滴定并没有明显变化。接下来,研究人员通过核极化效应方法测定了HMA在p7内的结合位点,发现与金刚烷乙胺不同,HMA结合于p7靠底部疏水区。研究人员随后与天津医科大学的王树青博士合作,通过分子动力学模拟手段,进一步精确地定位了该结合位点。研究结果表明,虽然HMA与金刚烷乙胺的结合位点不一样,但它们引起的p7构象变化类似,表明其抑制机理相似,结合位点均与疏水性相关,这将为研发以p7为靶点的新型药物分子起到一定的指导借鉴作用。

在周界文和欧阳波的指导下,博士研究生闰长青首先纯化出了有生物活性的蛋白质,利用与MgATP类似的MnATP对SCaMC进行滴定。MnATP中的Mn是顺磁性原子,会产生PRE效应,使得附近的核磁信号减弱,而且距离越近这种减弱效应越强烈。因此,底物结合位点附近的核磁信号会大幅度降低。研究人员继续使用MgATP滴定,以取代结合部位的MnATP,使结合部位的信号得到恢复,根据信号恢复的速度可以计算出底物结合的表观解离常数KD,排除非特异性的结合。利用这种新型核磁方法,研究人员鉴定出了MgATP的结合位点。通过蛋白脂质体实验,研究人员进一步确认了Asp361的突变,会导致蛋白对MgATP高选择性的丧失。这表明Asp361是MgATP结合的一个关键位点,该位点决定了SCaMC对MgATP的高选择性。

这项研究是中国科学院上海生命科学研究院巴斯德所的“百人计划”博士孙兵课题组与中国医学科学院金奇教授联合研究完成的,得到了国家传染病科技重大专项、国家科技部国际合作项目、国家自然科学基金、上海市科委,中国科学院项目基金、上海巴斯德健康研究基金会、李嘉诚基金会等项目资助。

该研究团队以流感病毒为研究对象,从自然界中广泛存在的五环三萜出发,通过活性追踪、先导化合物发现以及系统的构效关系的研究等,发现乙酰化半乳糖齐墩果酸具有强于达菲的抗流感活性。机制研究表明该类三萜衍生物作用于流感病毒血凝素蛋白的唾液酸受体结合口袋,抑制了病毒膜蛋白与宿主细胞受体的相互作用,从而抑制流感病毒对宿主细胞的附着能力,进而对H1N1、H3N2和达菲、金刚烷胺耐药珠甚至B型流感等病毒表现出广谱的抑制活性。更重要的是,此类先导物因阻断了流感病毒感染宿主细胞的必经通路,即使经多代传递仍没有表现出耐药现象,揭示出五环三萜调控流感病毒与宿主细胞的识别能力以及作为新型抗流感药物的广阔前景。相关成果已经申请国内外专利,部分结果发表在药物化学领域的代表性杂志上(Yu MR, et al. J Med Chem 2014, DOI: 10.1021/jm5014067)。

该项研究工作得到了中国科学院、国家自然科学基金委、上海“浦江人才”计划和美国国立卫生研究院的经费支持。该成果在国家蛋白质科学研究设施核磁共振系统完成数据收集工作。

该项研究工作得到了中科院、国家自然科学基金委和NIH的经费支持。该成果在国家蛋白质科学研究中心核磁共振系统完成数据收集工作。

EV71 是引起人手足口病的主要病原体之一,主要在新生儿和儿童中致病,其感染能够引起人中枢神经系统的病变,严重情况下会导致人死亡。近年来,EV71引起的手足口病在亚洲的多个国家和地区均有爆发,但是目前为止还没有针对该病毒的疫苗或有效的药物。许多病毒都可以编码小的疏水性膜蛋白,这些蛋白通常具有离子通道的某些特性,形成多聚体并且能够改变膜的通透特性。由于病毒的离子通道蛋白通常结构保守并且对病毒的生活周期有重要的作用,因此通常被认为是很好的抗病毒药物靶点。

此外,该研究团队还以丙肝病毒为研究对象,以前期建立的荧光标记病毒感染宿主细胞的“可视化”模型为基础,从板蓝根、川续断等传统抗病毒中药中发现的三萜皂苷类化合物出发,发现了活性好、溶解度大、无溶血副作用及成药性强的刺囊酸三萜先导物。机制研究借助生物素标记的刺囊酸小分子探针、免疫共沉淀、SPR、蛋白质谱等现代分析手段,阐明了该类先导物通过结合丙肝病毒的膜蛋白E2,抑制其与宿主CD81受体的相互作用,从而改变了丙肝病毒对宿主细胞的识别。相关成果也发表在药物化学领域的代表性杂志上(Yu F, et al. J Med Chem 2013, 56, 4300;Wang H, et al. Eur J Med Chem 2013, 64, 160)。

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孙兵研究组通过在研究EV71 2B蛋白在爪蟾卵母细胞中的电生理特性,发现2B蛋白能够介导氯离子依赖型的电流,并且能够被经典的氯通道抑制剂DIDS部分抑制。进一步的病毒学实验证明,DIDS能够在细胞模型中显著抑制细胞内病毒的RNA水平,并且减少病毒诱导的细胞毒性作用(Cytopathic Effect)。这项研究提示2B蛋白可能在EV71的生活周期中发挥了重要作用,并且为抗EV71药物的研发提供了新的可能的药物靶点

基于五环三萜调控蛋白和蛋白相互作用的潜能,该研究团队还进一步优化三萜结构,从最初发现的先导物齐墩果酸(EC50 10µM)、刺囊酸(EC50 1µM)、刺囊酸二糖衍生物(EC50 0.3µM),再到通过特殊连接臂构成的刺囊酸二聚体(EC50 3µM),活性提高了数千倍,是目前报道的针对丙肝病毒进入宿主细胞过程的活性最强抑制剂。将五环三萜与β-环糊精偶联得到的共价物,其抗病毒活性也有较大的提高,相关结果也已发表(Xiao SL, et al. ChemMedChem 2014, 9, 1060; Yu F, et al. Eur J Med Chem 2014, 77, 258)。另外,该研究团队与叶敏教授课题组合作,发现甘草次酸类五环三萜衍生物同样较好抑制流感病毒进入细胞活性,研究结果发表在天然药物化学领域的代表性杂志上(Song W, et al. J Nat Prod 2014, 77, 1632)。

HMA与金刚烷胺在丙型肝炎病毒离子通道P7内的结合位点的比较

鉴定MgATP结合位点的方法和MgATP的结合模型

上述研究成果表明,自然界广泛存在的、具有调控多种病毒与宿主细胞识别的五环三萜有可能是自然界抗病毒进化选择的产物,反映了其天然的抵抗病毒进入细胞的生源功能,对它的深入研究将有助于开发作用机制独特的新型抗病毒药物。此外,鉴于流感病毒唾液酸受体结合口袋的肤浅结构特征,血凝素蛋白一直不被看好为药物靶点,而五环三萜的疏水特性以及偶联特定糖后带来的特殊氢键,有可能构成突破这一困境的重要分子,为抗病毒药物研发带来新的思路。该课题得到了科技部重大研究计划(“973” 计划)、多项国家自然科学基金、澳门科学技术发展基金、北京大学“985”工程和北京大学-清华大学生命联合中心的支持。

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五环三萜先导物调控流感病毒与宿主细胞识别的可能机制

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